Comparison of different methods for exogenous DNA uptake by bovine spermatozoa / Comparação de diferentes métodos de incorporação de DNA exógeno pelo espermatozoide bovino

Although genetic manipulation of farm animals is of great interest for animal production and the pharmaceutical industry, its efficiency remains far from satisfactory. Pronuclear injection, which is the most widely used technique for such modification, mainly in mice, remains limited for this species. Some alternatives have been developed such as sperm mediated gene transfer, in which the spermatozoa are used as vectors for DNA delivery during in vitro fertilization. Mature sperm cells are able to spontaneously bind exogenous DNA molecules which may be internalized into sperm nuclei. Given the potential of sperm mediated gene transfer for livestock animals transgenesis, the aim of this study was to evaluate four methods of DNA uptake for sperm mediated gene transfer in bovine: incubation with DNA, plasma membrane alteration induced by calcium ionophore followed by incubation with DNA, electroporation and lipofection. Spermatozoa not exposed to exogenous DNA were used as control group. Cleavage, blastocyst and hatching rates were recorded at 72 hours post insemination (hpi), days 9 and 12 of embryo culture, respectively. Exogenous DNA-positive embryos were evaluated by PCR. No effect of treatment was observed on cleavage, blastocyst and hatching rates. In addition, percentage of DNA positive blastocysts did not differ among experimental groups. In spite of the low number of positive embryos, our results show that all treatments presented similar efficiencies for DNA delivery during in vitro fertilization. In conclusion, although the development rates were similar and constant in all groups, other factors such as exogenous DNA sequence, size and concentration should be considered to improve sperm mediated gene transfer.

Apesar da manipulação genética de animais domésticos ser de grande interesse para a produção animal e para a indústria farmacêutica, a sua eficiência ainda é insatisfatória. A injeção pronuclear, a técnica mais utilizada para tal propósito, principalmente em camundongos, ainda apresenta limitações para esta espécie. Algumas alternativas têm sido desenvolvidas como o uso de espermatozoides como vetores para transferência gênica, na qual a célula espermática tem habilidade espontânea de se ligar à molécula de DNA e internalizá-la. Dado o potencial da transferência gênica mediada por espermatozoide para animais domésticos transgênicos, o objetivo do presente trabalho foi a avaliação de quatro métodos de incorporação de DNA para a transferência gênica mediada por espermatozoides na espécie bovina: incubação com DNA, alteração da membrana plasmática induzida por cálcio ionóforo seguida por incubação com o DNA exógeno, eletroporação e lipofecção. Espermatozoides não expostos ao DNA exógeno foram usados como grupo controle. Os índices de clivagem, blastocisto e eclosão foram avaliados, respectivamente, as 72 horas após a inseminação dos oócitos, bem como, aos 9 e 12 dias de cultivo embrionário. Os embriões positivos para o DNA exógeno foram avaliados por PCR. Nenhum efeito de tratamento foi observado nos índices de clivagem, blastocisto e eclosão. Além disso, a porcentagem de blastocistos positivos para o DNA exógeno não diferiu entre os grupos experimentais. Apesar do baixo número de embriões positivos para DNA exógeno, os resultados obtidos mostram que todos os tratamentos apresentaram eficiências similares. A conclusão obtida foi que, apesar de os índices de desenvolvimento embrionário terem sido similares e constante em todos os grupos experimentais, outros fatores como a sequência, o tamanho e a concentração do DNA exógeno devem ser avaliados para melhorar a transferência gênica mediada por espermatozoides.

Maturação e desenvolvimento embrionário in vitro de oócitos bovinos após bloqueio da meiose com inibidores de MPF / In vitro maturation and embryo development of bovine oocytes after meiosis blockage with MPF inhibitors

O objetivo deste estudo foi avaliar a maturação e o desenvolvimento embrionário após a fecundação in vitro de oócitos bovinos que tiveram a maturação bloqueada com Butirolactona I e Roscovitina em meio de pré-maturação suplementado com soro fetal bovino (SFB). Oócitos foram divididos em 4 grupos: Controle 0 hora, Controle (maturação por 24 horas), Butirolactona I (bloqueio da maturação com 150μM de Butirolactona I por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação) e Roscovitina (bloqueio da maturação com 50μM de Roscovitina por 24 horas, seguido de 24 horas de maturação). Para avaliar a maturação nuclear, os oócitos foram fixados e corados em aceto orceína. Parte dos oócitos dos grupos Controle 24 horas, Roscovitina e Butirolactona I após o período de maturação, foi fecundado in vitro. O desenvolvimento embrionário foi avaliado pelos índices de clivagem (D3) e formação de blastocistos (D7). Oócitos do grupo Butirolactona I apresentaram índices de Vesícula Germinativa após o bloqueio e de Metáfase 2 após a maturação semelhantes ao dos grupos Controle 0 hora e Controle, respectivamente. Por outro lado, a Roscovitina apresentou menores índices de Vesícula Germinativa e Metáfase 2. Os grupos Controle e Butirolactona I apresentaram maiores índices de clivagens. O grupo Controle apresentou maior produção de blastocistos que o Roscovitina e não diferiu do grupo Butirolactona I. Conclui-se que a Butiroloactona I pode ser utilizada no sistema de pré-maturação em meio contendo SFB, pois apresentou resultados semelhantes ao do grupo Controle o mesmo não ocorrendo com a Roscovitina, que apresentou menores índices de maturação oocitária e de desenvolvimento embrionário.

This study evaluated the bovine oocyte maturation and embryo development after in vitro fertilization. The maturation of the oocytes was blocked using Butyrolactone I and Roscovitine using pre-maturation medium supplemented with fetal calf serum (FCS). The ocytes were divided in four groups: Control 0 hour, Control (24 hours of maturation), Roscovitine (maturation blockage with 50mM Roscovitine during 24 hours followed by 24 hours of maturation), and Butyrolactone I (maturation blockage with 150mM Butyrolactone I during 24 hours followed by 24 hours of maturation). The oocytes were fixed and stained with aceto orcein to evaluate the nuclear maturation. After the maturation period, the remaining oocytes of the Control group, Roscovitine, and Butyrolactone I were fertilized in vitro. Embryo development was assessed by the cleavage rate (D3) and blastocysts formation (D7). The Butyrolactone I group had similar rates of germinal vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation, comparing to Control group at 0 hour and Control group, respectively. On the other hand, the Roscovitine group had lower rates of vesical stage oocytes during blockage, and Metaphase 2 after maturation comparing to Control groups. After in vitro fertilization, higher rates of cleavage were observed in Control and Butyrolactone I groups. For the blastocyst formation rate, the Control group showed better results than Roscovitine group. In summary, Butyrolactone I group had similar results to the Control group, and for this reason, is suitable for pre-maturation of bovine oocytes using FCS. In contrast, Roscovitine group had lower oocyte maturation and embryo development.

Criopreservação e desenvolvimento in vitro de embriões bovinos / Cryopreservation and in vitro survival of bovine embryos

O objetivo deste trabalho foi estudar a remoção do crioprotetor, em duas ou três etapas, em embriões bovinos produzidos in vitro após a congelação em vapor de Nirtogênio. Blastocistos expandidos (1329) foram mantidos em co-cultivo (controle) ou criopreservados em 3 protocolos de congelação em vapor de nitrogênio. Os embriões foram equilibrados na solução de 10% de EG por 10 minutos e em 17%, 22% ou 28% de EG por 30 segundos. Após o envase, as palhetas foram mantidas em vapor de nitrogênio por 2 minutos e armazenadas em nitrogênio líquido. Após a descongelação, os crioprotetores foram diluídos em duas etapas, usando 0,3M de sacarose e solução isotônica ou em três etapas usando 0,3M de sacarose + 10% de EG; 0,3M de sacarose e solução isotônica. Os embriões foram co-cultivados com células da granulosa, avaliando as taxas de re-expansão após 24 horas e de eclosão após 24, 48, 72 e 96 horas. Para os grupos congelados no vapor e diluição do crioprotetor em duas etapas, as taxas de eclosão foram de 1,94; 11,88 e 6,06% para EG17, EG 22 e EG 28 respectivamente. Já para os grupos com diluição do crioprotetor em três etapas, as taxas de eclosão foram de 4,67; 9,90 e 10,78% para EG17, EG22 e EG28 respectivamente.

The aim of this study was to evaluate the dilution of cryoprotectant in 2 or steps of bovine in vitro-produced embryos after quick-freezing. A total of 1329 expanded blastocyst were kept in co-culture as control group or cryopreserved by 3 quick-freezing protocols. The embryos were exposed to 10% EG for 10 minutes then to 17%, 22% or 28% for 30 seconds. After loading, the straws were held in nitrogen vapor for 2 minutes and then plunged and stored in liquid nitrogen. After warming, cryoprotectants were diluted in two steps using 0.3 M sucrose and isotonic solution, or three steps using 0.3 M sucrose + 10% EG then 0.3 M sucrose and isotonic solution. Embryos were co-cultured on a granulosa cell monolayer and evaluated after 24 hours for re-expansion and at 24, 48, 72 and 96 hours of co-culture for hatching rates. The in vitro survival rates of embryos cryopreserved by the quick-freezing method and two-step cryoprotectant dilution were 1.94; 11.88 and 6.06%, for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively. At the three step dilution, the in vitro survival rates were 4.67; 9.90 and 10.78% for EG17, EG22 and EG28 groups, respectively.